تاریخچه DNA و اطلاعاتی از آن
RFLP اولین بار در سال 1974 به عنوان یک مارکر ژنتیکی توسطGrodzicker و همکاران برای تعیین جهش در ویروس به کار گرفته شد. استفاده ازRFLPبه عنوان مارکر بیماری ژنتیکی‌اولین بار توسطKon و Dozy (1974) برای آنالیز بیماری کم خونی داسی شکل به کار گرفته شد.Botstein و همکاران 1980تئوری پایه این روش را برای نقشه‌یابی ژنهای مرتبط با بیماری درانسان مطرح کردند. Southern روش انتقال الگویDNA و پروب (کاوشگر) از ژل به‌غشاء نیتروسلولزی درRFLPرا ابداع کرد.
Backman (1986) برای اولین بار استفاده از این نشانگر را مطرح نمود. کاربردهای مهم همچون نقشه‌یابی و دستکاری مکانهای ژنهای کنترل کننده صفات کمی با استفاده ازRFLPدر سال1983 توسطBackman وSoller بیان گردید. با گسترش کاربرد این نشانگر قدرتمند چند ژن یا ژنوم‌آنالیز شدند تعدادی از گونه‌های دام چون گاو، گوسفند، بز، اسب، خوک و جوجه نیز با استفاده از این‌نشانگر آنالیز شدند
کلیات تکنیک
مشخص شده است که ژنوم موجودات به طور طبیعی دارای تفاوتهائی در ردیف بازهای خطی می‌باشند این تغییرات طبیعی که سبب گوناگونی در افراد یک جمعیت میشود چند شکلی ژنتیکی‌نام دارد. اگر این چند شکلی در ردیف بازهایDNA در جایگاه شناسائی آنزیم محدودکننده ایجادشده باشند به راحتی قابل ردیابی استRFLP . وجود الگوهای غیریکسان است که بر اثر هضم‌آنزیمی یک ناحیهِ خاص ازDNA بوسیلهِ آنزیمهای محدود کننده مشخص میشود. این الگوهای‌غیریکسان به علت تفاوتDNA بسته به حضور یا عدم حضور جایگاه آنزیمهای محدود کننده‌بوجود می‌آید این الگوها را به دو شکل می‌توان مشخص کرد .
- هضم آنزیمی و سپس الکتروفوز و استفاده از لکه‌گذاری سادرن
PCR فطعه مورد نظر و هضم آنزیمیRFLP مستقیما روی تظاهر ژن از طریق تغییر در شکل‌گیریmRNA و میزان و تعداد نسخه‌برداری تاثیر می‌گذارد.
آنزیمهای محدودگر
آنزیمهای برشی دسته‌ای از آنزیمهای آندو نوکلئاز به شمار می‌روند که یک ردیف اختصاصی از بازها را در درون مولکولDNA دو رشته‌ای شناسائی می‌کنند .
در سال 1970 سویه‌های معینی از باکتری که قادرندDNA خارجی را که وارد سلول آن شده تجزیه کنند، کشف گردید. چون با این آنزیمها، سویه‌های ویژه‌ای از باکتری قادر بودند که آلوده‌کنندگی فاژ یا ویروس را کاهش دهند و در واقع زمان میزبانی باکتری را محدود کنند به اسم آنزیم‌محدودگر نامیده می‌شذتد. به دلیل اهمیت این پدیده و نقش کلیدی آن در پیشرفت ملکولی کاشفین‌این آنزیمهای محدودگر سه نفر به اسم آلبر(Albet) )، اسمیتSmith)) )، ناتنز (Nathan)بودند که موفق به دریافت جایزهِ نوبل شدند در بیشتر مواقع توالی شناخته شده این آنزیمها یک پالیندروم است که معمولاإ شامل چهار شش جفت باز دارای تقارن دو طرفی است، یعنی از چپ و راست به یک صورت خوانده میشود.
زمانی که یک آنزیم برشی بهDNA اضافه میشودDNA از بسیاری از مکانها که از آنها قبلاعنوان سایت برشی یاد شد، شکاف برمی‌دارد و در اصط‌لاح هضم میشود. حاصل فرآیند هضم،تعدادی قطعه است، در ذیل چند مثال از آنزیمهای برشی آورده شده است:
در روشRFLP ابتدا نمونه‌ای ازDNAرا با یکنوع آنزیم برشی، هضم می‌کنند که در نتیجه تعداد زیادی قطعه با طول متفاوت بدست می‌آید، سپس این قطعات با استفاده از ژل آگارز ازهمدیگر جدا می‌شوند شناسائی وتشخیص یک قطعه‌خاص با استفاده از کاوشگرها امکانپذیر است‌که این عمل با استفاده از تکنیک دیگری تحت عنوان لکه‌گذاری سادرن صورت می‌گیرد.
پروب یا کاوشگر
قطعهِ خاصی ازDNAرا که متعلق به توالی از یک ژن خاص یاcDNA می‌باشد، بوسیله آنزیمهای برشی خاص هضم و قطعات حاصل در حاملهایی (پلاسمید) که توسط همان آنزیم‌محدودگر برش داده شده‌اند جاگذاری میشود. این پلاسمیدها جهت تکثیر و نگهداری به باکتریهای‌آزمایشگاهی که اغلب اشریشا کلی هستند منتقل می‌شوند. کلونهای یاد شده توسط رادیو ایزوتوپها یامواد شیمیایی چون بیوتین نشاندار میشود. در صورت وجود همگنی ردیف بازی مشابه بین پروب‌وDNA هضم شده اتصال بین این دو برقرار خواهد گردید.
لکه‌گذاریSouthern
برای انجام عمل هیبرایداسیون لازم است که علاوه بر قطعه کاوشگر، قطعاتDNA هضم شده نیز تک رشته‌ای شوند لذا ابتداDNA روی ژل آگارز که حاوی قطعات هضم شده است درمحلولهای قلیائی مثل اوره یا فرمالدئید یا هیدروکسیدسدیم تک‌رشته می‌نمایند. سپس صفحه‌ای ازغشاء نیترو سلولزی را روی قسمت فوقانی ژل قرار داده و روی آن غشاء مقداری کاغذ جاذبه الرطوبه‌می‌گذارند محلول بافر تانک الکتروفوزر بوسیله فشار اسمزی کاغذ فوقانی بالا کشیده میشود و حین‌عبور از ژل به غشاء نیترو سلولزی که دارای بار مثبت است منتقل می‌گردد. با تسهیل عمل‌هیبریداسیون بین کاوشکر و قطعاتDNA هضم شده در معرض پروب نشاندار رادیواکتیو در نقاطی‌که همولوژی وجود دارد هیبرید می‌گردد. قطعاتی که هیبریداسیون در آنها صورت نگرفته است ازمحیط شسته می‌شوند و سپس از غشای نیترو سلولزی در مجاورت فیلم عکاسی اتورادیوگرافی‌بعمل می‌آید پس از ظهور و ثبوت فیلم قطعات ویژه‌ای ازDNA که با پروب هیبرید هستند به‌صورت یک باند مرئی دیده میشود شکل زیر مراحل انجام لکه‌گذاریSouthern را نشان می‌دهد.مزایایRFLP عبارت است از موارد زیر می‌باشد:
- تحت تاءثیر محیط نیست و صددرصد ژنتیکی است
- همبارز است
- تکرار پذیری آن بالاست
PCR-RFLP(PBR)
در روش دومRFLP ، ابتدا قطعه حاوی جایگاه چند شکلی را با واکنش زنجیرهِ پلیمراز واستفاده از دو پرایمر مخصوص که به همین منظور طراحی شده تکثیر می‌نمایند و پس از هضم‌آنزیمی، الکتروفوز می‌کنند. درPBR جهشهائی از نوع نقطه‌ای و حذف و اضافه که باعث تغییر درسطح قطعه آنزیمی می‌گردند قابل تشخیص است
فرق لکه‌گذاری سادرن وPBR
در RFLPسادرن تنوعDNAدر داخل یک منطقهKb 30 محصور توسط پروب تعیین می‌گردد در حالیکه درPBR تنوع در داخل منطقه‌ای که از دو طرف به پرایمر ختم شده تعیین‌می‌شود این ناحیه معمولاKb2-0.5است. علاوه بر این درPBRمزایائی چون سادگی، سرعت‌زیاد، عدم نیاز به مواد رادیواکتیو و تکرارپذیری بالا مطرح می‌باشد
میزان پلی‌مورفیسم و تعداد آللها درPBR کمترازRFLPسادرن می‌باشد عباسی (1376)نشانگرPBRبرای تشخیص پلی‌مورفیسم در ژن هورمون رشد گاوهای هلشتاین استفاده‌کرد Aggreyو همکاران (1999) از مارکرPBR برای تشخیص پلی مورفیسم در ناحیهِ مجاور ژن گیرنده هورمون رشد در گاوهای هلشتاین کانادا استفاده نمودند و الگوهای باندی مختلفی را درروی ژل مشخص نمودند
PCR-SSCP
این روش در سال 9891 ابداع شد. زمانی کهDNAدو رشته‌ای در روی ژل الکتروفوز حرکت داده میشود. حرکتDNA به اندازه قطعه بستگی دارد بطوریکه مولکولهای کوچک از منافذ ژل به‌آسانی عبور می‌کنند. در الکتروفوزSSCPابتدا از یک مادهِ دناتوره کننده (واسرشت کننده) مانند اوره‌برای تبدیلDNA دو رشته‌ای به تک رشته‌ای استفاده میشود.
در هنگام راندنDNA تک رشته در ژل، اثر متقابل داخل مولکولی روی می‌دهد. به عبارت دیگرDNA رشته قادر است در بخشهائی با خود باند تشکیل دهد بنابراین حرکت مولکولها دراین حالت بیشتر به ساختار مولکولیDNA تک رشته نیز وابسته است (ساختمان سوم)
ساختمان سوم در قطعه تک رشته وابسته به توالی کل قطعه است اگر جهش در توالیA رخ دهد ساختار قطعه تغییر می‌یابد. اگر پلی مورفیسم در قسمت آغازین محصولPCR باشدشناسائی آن باSSCP بسیار راحت‌تر است.
PCR-DGGE
DGGE یکی از روشهای مناسب برای آشکار سازی جهشها است. این روش بررسی فرآورده‌های زنجیره پلیمراز صورت می‌گیرد. در صورتیکه قطعات رشتهDNA در یک نوکلئوتید باهم متفاوت باشند، الگوی واسرشت شده متفاوتی را نشان می‌دهند. در این روش دو نمونهDNA دردو ستون جداگانه از یک ژل پلی‌اکریلامید که دارای نسبتی از غلظت ماده واسرشت کننده (معمولافرمامید) است، مورد الکتروفورز قرار می‌گیرد. وقتی مولکولها به سطح بحرانی دناتوره می‌رسند، دورشتهDNA شروع به جدا شدن می‌کنند در این حالت کاهش معنی‌داری در حرکت قطعات ایجادمی‌شود. این نقطه به عنوان نقطه ذوب عمل می‌کند و باعث تاءخیر در حرکت مولکولDNA جهش‌یافته نسبت به فرم وحشی می‌گردد
DGGE به مواد رادیواکتیو و مواد شیمیائی سمی احتیاج ندارد ولی ابزار پیشرفته‌می‌خواهد درصد تعیین موتاسیون در این روش خیلی نزدیک به 100% است. نوع مشابه‌ای از این‌روشTGGEمی‌باشد که در آن از حرارت بجای غلظت مواد شیمیائی در ژل استفاده میشود. شکلهای پیوست چگونگی انجام تکنیکDGGE را نشان می‌دهد.بهترین طول قطعات برایDGGE بینbp 150-1500می‌باشد. برای واسرشت شدن کامل قطعات حاصل از زنجیرهِ پلیمراز از یک ناحیه حاوی بالاترین دمای ذوب مصنوعی به نامGC-clamp استفاده میشود نمونه‌ای از استفاده از مارکرDGGEرای یافتن پلی مورفیسم دراگزون ده گیرندهِ هورمون رشد توسط جیGe و همکاران (1999) انجام شده است
PCR-ARMS
روشARMS روش سریعی برای تعیین جهشهای نقطه‌ای و حذف و اضافه‌ها است. این روش اولین بار توسطNewton و)Groham 1994 (برای آنالیز بازهای متفاوت دروالدین حاوی کمبود آنتی‌ترپیسین و همچنین برای تشخیص والدین ناقل بیماری سیستیک‌فیبروزیس و بتاتالاسمی بکار گرفته شد.
این تکنیک براساس طراحی پرایمرهای اختصاصی آللها درPCRمی‌باشد. برای تشخیص یک جهش ویژه، دو پرایمر کنترل در نزدیکی محل موتاسیون برای اطمینان از عمل صحیحPCR طراحی میشود. برای تکثیر منطقهِ حاوی جهش نیز یک پرایمر مشترک برای الل موتانت و وحشی‌طراحی‌می‌گردد. دو پرایمر باقی مانده همان پرایمرهایARMS می‌باشد که باز َ3 آنها به‌ترتیب مکمل توالی الل موتانت و الل وحشی هستند. چنانچه پرایمرARMSدارای َ3 مکملDNA الگو بود، همراه با پرایمر مشترک قطعه ما بین دو پرایمر تکثیر می‌گردد و ما در روی ژل دو باند رامشاهده می‌نمائیم.
اگر پرایمرARMSدارای َ3 مکملDNA الگو نبود، فقط یک باند در روی ژل که حاصل تکثیرمنطقه بین دو پرایمر کنترل می‌باشد، مشاهده می‌گردد. زیرا انتهای َ3 ناجور جفت شدگی دارد وباعث جلوگیری از عمل پلی مراز به جهت دور شدن َ3 آغازگر ازDNA میشود آقائی(1376) اولین بار در ایران از این نشانگر برای شناسائی جهشهای ژن کاپاکازئین در گاوهای بومی‌ایران استفاده نمودند
AFLP
Zabeau و همکاران (1993) روش جدیدی را تحت عنوان تکثیر قطعات برش یافتهِ انتخاب ابداع کردند که حاصل آنAFLP است. این روش ترکیبی ازPCR وRFLPمی‌باشد. درسال1995،Vosو همکاران از این روش برای انگشت نگاری ژنومهائی که از لحاظ چند شکلی در طول‌قطعات حاصل از هضم، بسیار بهم نزدیک بودند استفاده نمودند
مزایایAFLP
نیاز به پروب ندارد
دمای اتصال پرایمر به الگو بسیار بالاست
معمولا غالب است و زمانی همبارز است که سایت برشی پلی مورفیک کاملا داخل قطعه‌باشد
ریزماهواره‌ها
واژه ریزماهوار در سال 1985 بوسیلهJeffery مطرح گردید و مفهوم آن توالیهای کوتاه تکرارشونده در ژنوم موجودات می‌باشد. ریزماهواره‌ها توزیع وسیعی را در اکثر گونه‌های مهره‌داران به‌خود اختصاص داده‌اند معمولترین تکرارها در ژنوم پستانداران، تکرارهای دو نوکلئوتیدیCA)n و(CT)n وdG - dT)n ) می‌باشد.
تعداد باز موجود در هر ردیف تکرار شونده ممکن است دو، سه، چهار یا حتی بیشتر با برای طراحی پرایمر از خود این نوکلئوتیدهای تکراری استفاده میشود.
کاربرد میکروساتلیتها به عنوان آغازگر اولین بار توسط لیکفدت و همکاران بحث شده است چون میکروساتلیتها چند شکلی بالائی دارند می‌توانند به آسانی درPCRردیابی شوند. نقشه‌یابی ژن با این مارکر در گونه‌هائی مانند گاو که بیش از 400میکروساتلیت شناخته شدهدارد، سریعتر صورت خواهد گرفت در حالی که هر دو الل یک مکان ژنی را می‌توان باRFLPمورد تجزیه قرار داد، در میکروساتلیت‌بندرت می‌توان تعیین کرد یک قطعه خاص در حالت هموزیگوت یا هتروزیگوت بوجود آمده است.
از میکروساتلیت برای کشف اشتباهات موجود در ثبت والدین برای نتاج در مراکز اصلاح نژاداستفاده میشود و در پیش‌بینی ارزشها اصلاحی بکار گرفته میشود. بعضی از مشکلات استفاده ازماهوارکها به شرح زیر است.
عملیات شناسائی ریز ماهواره‌ها، تعیین توالی بازی آنها و طراحی و ساخت آغازگرها
تهیه نقشه ژنتیکی بسیار پیچیده بوده و مستلزم صرف وقت و هزینه فوق‌العاده است.
به علت پلی‌مورفیسم زیادتر از حد ریز ماهواره‌ها کاربرد آنها فقط در رده‌بندی‌های درون گونه‌ای پیشنهاد می‌گردد Lucy و همکاران (1998) از این مارکر برای بررسی پلی‌مورفیسم در ناحیه پیش‌بر(پروموتور) ژن گیرندهِ هورمون رشد استفاده نمودند
STS وALP
وجود اختلاف در اندازهِ قطعات حاصل ازPCR که در آن دو پرایمر هدفمند از توالی ژن بکار رفته است راALP گویند. این اختلاف بیانگر وقوع پدیده حذف یا اضافه شدن این نشانگراست که اولین بار بوسیله Olson (1989) مطرح گردید.برای مشاهده پلی مورفیسم از نوع حذف و اضافه در ALP لازم است که حداقل 10 جفت بازدر این نوع جهش شرکت داشته باشند.
نشانگرRAPD
در سال 1990 دو گروه تحقیقاتی همزمان روشی را برای سنجش میزان چند شکلی ابداع کردند یک گروه در شرکت دوپونت که روش خود راRAPD نامیدند و گروه دیگر در موِسسه‌تحقیقات زیست شناسی کالیفرنیا که روش خود را واکنش زنجیرهِ پلی مراز با پرایمر تصادفیArbitrarily Primed PCR نامیدند.در این روش یک آغازگر چند نوکلئوتیدی کوتاه که بطور تصادفی از توالیهای بازیA انتخاب شده است در مجاور سایر مواد لازم برای تکثیر درPCR قرار می‌گیرد. در این تکنیک چندشکلی‌هایDNA یا از اختلافات موجود در توالیDNA در مکانهای اتصال آغازگر یا از طریق‌دگرگونیهائی که در اثر اضافه شدن و حذف و انورسیون در نواحی تکثیر شده روی داده است‌مشاهده می‌گردد.اگر مکانهای اتصال آغازگر روی دو رشته الگو، در فاصلهِ مناسبی قرار گرفته باشند،DNA پلیمراز قادر به طی کردن فاصله دو پرایمر اتصالی خواهد بود. در این روش بطور کلی ازآغازگرهائی با طول 9-10نوکلئوتید با حداقل محتوای 50 GC%استفاده میشود.
مارکرRAPDیک مارکر غالب است و در آن ژنوتیپ افراد هتروزیگوت رانمی‌توان تشخیص داد. این مسئله باعث کم ارزش شدن آن درF2شده است کاربردRAPDدرگونه‌های پستاندار محدوداست وکمتر درمطالعات حیوانی استفاده می‌شودعلاوه‌بر غالبیت، دمای اتصال پایین به علت کوتاهی پرایمرها احتمال وقوع اتصالات اشتباهی را بالامی‌برد. میرحسینی و همکاران (1374) از مارکرRAPDبرای تعیین چند شکلی در لاین‌های کرم‌ابریشم ایران استفاده‌نمود
آزادی (1378) با استفاده از این مارکر فاصله ژنتیکی پنج نژاد گوسفند ایرانی را بررسیکرد (3). ولی‌الهی و همکاران (1379) ازمارکرRAPD اولین بار برای مطالعه گونه‌ای برخی باربوس‌ماهیان ایران استفاده نمودند
DAF
در سال 1991 این تکنیک توسطCaetano-Anolles پیشنهاد شده است. این نشانگر از نظراصول مشابه با روشRAPD می‌باشد و تفاوتهای آن با روشRAPD در طول آغازگر، سیکل‌حرارت مورد استفاده درPCR ، نوع ژل و رنگ آمیزی می‌باشد.
SCAR
Michelmore و همکاران (1993) نوع جدیدی از نشانگرهای مولکولی را که از روش RAPD مشتق شده بود و مشکلات مربوط به آنها را نداشت ابداع نمودند.در این روش قطعات حاصل ازRAPDرا کلون و تعیین توالی می‌کنند و در مرحله بعد آغاز24وکلئوتیدی را که مکمل انتهای قطعهِ توالی یابی شده می‌باشد را طراحی می‌نمایند. وقتی این‌آغازگر باDNA الگوی اصلی درPCRبه کار رود یک مقرر ژنی که اصط‌لاحاإ اسکار(SCAR)نامیده‌می‌شود تکثیر میشود
برچسب: ،
